Como sabemos desde hace mucho tiempo, la naturaleza es una excelente fuente de inspiración para muchos estudios, descubrimientos y experimentos. Los pájaros y los insectos alados nos han demostrado que el cielo es bastante alcanzable, los mamíferos acuáticos nos han mostrado cómo prolongar nuestra estancia bajo el agua y las arañas han demostrado que incluso las criaturas más pequeñas pueden crear algo increíble. En el estudio que estamos considerando hoy, científicos del Instituto de Investigación Física y Química (Wako, Japón) han encontrado una forma de crear una red artificial utilizando bacterias fototróficas. ¿Cómo lograron exactamente esto, qué tan naturales son las telarañas resultantes y por qué se usaron bacterias fototróficas? Las respuestas a estas y otras preguntas nos esperan en el informe de los científicos. Vamos.
Base de investigación
Para muchas personas, las arañas son "¡Dios mío, quítamelo de encima!" o "ugh, qué repugnante". Sin embargo, dejando de lado las fobias y los prejuicios contra estas criaturas, uno puede considerar cuán únicos son estos depredadores de ocho patas. La anatomía de la araña está literalmente hecha para una caza perfecta. Por un lado, existe un veneno que puede paralizar o incluso matar a la presa o al enemigo. Por otro lado, hay órganos de los sentidos bien desarrollados (especialmente el tacto debido a la tricobotria (pelos) en todo el cuerpo). La tarjeta de visita de las arañas, que se ha convertido en la base de muchas metáforas y eslóganes, es su telaraña.
Un video sobre cómo las arañas producen su famosa telaraña.
En su núcleo, una red es una proteína, cuya composición es rica en glicina (C 2 H 5 NO 2 ), alanina (NH 2 -CH (CH 3 ) -COOH) y serina (HO 2 C-CH (NH 2 ) CH 2 OH ). Se forma una telaraña en una glándula especial, donde está en forma líquida.
Cuando la secreción de la glándula se secreta a través de numerosos tubos giratorios, de ella se forman verrugas especiales de araña que la araña usa para construir sus trampas mortales.
Los hilos de tela de araña son únicos porque sus propiedades mecánicas son superiores a muchos otros materiales. Por ejemplo, la resistencia a la tracción de una telaraña para una araña ordinaria ( Araneus diadematus ) es de 1,1 a 2,7 GPa, para un cabello humano es de 0,25 GPa y para el acero es de 0,4 a 1,5 GPa. La densidad de la seda de araña es 1/6 de la del acero (1,3 g / cm 3 ). Es decir, si das la vuelta a la Tierra con una red, entonces su peso será de solo 500 gramos. La densidad de energía de aproximadamente 1,2 × 108 J / m 3... La seda de araña también es extremadamente flexible, es decir Puede estirarse hasta 5 veces su longitud original (en un estado relajado) sin interrupciones. La resistencia al impacto de las telas de araña es comparable a la de los hilos de poliaramida. Las arañas no son extremófilas, pero sus telas pueden sobrevivir fácilmente a temperaturas de -40 ° C a 220 ° C. Además, las propiedades biodegradables y biocompatibles de la seda la hacen adecuada para aplicaciones médicas.
Comparación de la resistencia a la tracción del hilo de acero y la seda de araña (densidad correspondiente).
También es curioso que un tipo de araña pueda producir varios tipos de telarañas que son diferentes en propiedades y uso (las arañas de la especie Argiope argentata producen hasta 5 variantes de la telaraña):
- para los bordes exteriores y el marco de la red (muy duradero);
- para zonas de captura de presas (muy pegajosas, elásticas y duraderas);
- ( );
- ( 2 3 );
- ;
- .
Esta es solo una breve descripción de la seda de araña, pero incluso eso es suficiente para comprender la singularidad de esta sustancia. Es por eso que muchos científicos han estado intentando durante mucho tiempo crear un equivalente artificial de la web. Para muchos, esto es bastante exitoso. Sin embargo, el problema de la producción en masa sigue sin resolverse.
En el trabajo que estamos considerando hoy, los científicos han propuesto una solución a este problema. Consiste en utilizar la bacteria púrpura Rhodovulum sulfidophilum , que tiene propiedades tanto de fotótrofos * como de halófilos * .
Los fotótrofos * son organismos que utilizan la luz para generar energía.
Los halófilos * son un tipo de extremófilos que viven en condiciones de alta salinidad.R.sulfidophilum es una bacteria fotosíntesis * anoxigénica marina con diferentes características metabólicas que produce biohidrógeno, bioplásticos y ácidos nucleicos extracelulares.
Fotosíntesis anoxigénica * : a diferencia de la fotosíntesis convencional, el oxígeno molecular no se forma durante la fotosíntesis anoxigénica.Pero la habilidad más importante de R.sulfidophilum para los científicos es su capacidad para crecer en condiciones fotoautótrofas mediante el uso de recursos económicos y renovables como la luz (energía), el CO 2 (fuente de carbono) y el N 2 (fuente de nitrógeno) a través de los procesos de fotosíntesis y fijación. nitrógeno. Además, R.sulfidophilum prospera en el agua de mar, lo que ayuda a reducir el riesgo de contaminación biológica durante el cultivo.
En los últimos años, se han logrado buenos resultados en la producción masiva de espidroína (MaSp, proteína de seda de araña) utilizando organismos hospedadores recombinantes (bacteria Escherichia coli , levadura Pichia pastoris , gusano de sedaBombyx mori , tabaco, cultivos de células de mamíferos, etc.).
Los autores de este trabajo no niegan el éxito de sus predecesores, pero notan volúmenes de producción extremadamente pequeños y un costo bastante alto del producto final debido al alto costo de producción en sí (en el caso de la fermentación microbiana, el 70% de los costos de producción son materias primas).
En su estudio, los autores proponen un nuevo método para la producción económica y eficiente de seda de araña utilizando la bacteria R.sulfidophilum , capaz de producir una secuencia repetida hidrófoba MaSp1 (espidroína-1) utilizando una pequeña cantidad de materia orgánica en condiciones de crecimiento fotoheterótrofo o fotoautótrofo.
Resultados de la investigacion
Primero fue necesario preparar la bacteria R.sulfidophilum .
La posibilidad de introducir ADN plasmídico exógeno en R.sulfidophilum mediante conjugación bacteriana * utilizando plásmidos obtenidos de pCF1010 y E. coli S17-1 como cepa donante se ha informado previamente .
Conjugación * : transferencia unidireccional de una parte del material genético durante el contacto directo de dos células bacterianas.En este estudio, se decidió utilizar un vector diferente (pBBR1MCS-2) que contenía un gen de resistencia a la kanamicina, un gen mob que codifica una nucleasa específica y una fuente de transferencia ( oriT * ), que fueron ampliamente utilizados en la conjugación de bacterias gramnegativas.
oriT * es una secuencia corta (hasta 500 pb) necesaria para la transferencia de ADN que lo contiene de un huésped bacteriano a un receptor durante la conjugación bacteriana.En el cromosoma de R.sulfidophilum (número de acceso NZ_CP015418), estaban presentes dos genes de resistencia al telurito que codifican una proteína de resistencia al telurito de la familia TerB en los loci A6W98_RS06280 y A6W98_RS17070.
Los rasgos de resistencia a kanamicina y telurito se utilizaron como marcadores para la selección de conjugantes positivos de R. sulfidophilum .
El plásmido * pBBR1-Ptrc-MaSp1 contenía:
- el promotor * trc (Ptrc), que es un potente promotor constitutivo híbrido en E. coli;
- la secuencia "AGGAGA" de la región de unión al ribosoma (RBS);
- MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).
* — , .
* — , - ( ).Se obtuvieron aproximadamente 0,4 g de masa celular húmeda (CWM de masa celular húmeda ) a partir de 50 ml de cultivo de R. sulfidophilum recombinante desarrollado hasta crecimiento estacionario en condiciones fotoheterotróficas, es decir, de caldo de mar (MB de caldo marino ) con iluminación LED en (730 nm, 20-30 W / m 2 ) durante 4 días.
Imagen # 1
A pesar del hecho de que la sobreexpresión de las proteínas recombinantes MaSp1 no se detectó claramente en todos los cultivos recombinantes de R. sulfidophilum usando electroforesis en gel de poliacrilamida / SDSPAGE ( 1c), la expresión positiva de las proteínas MaSp1 se confirmó mediante inmunotransferencia de proteínas para todas las células de R.sulfidophilum recombinantes creadas que llevan pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mer, 2-mer, 3-mer, o 6-mer) ( 1d ).
Medidas K * : subsecuencias de longitud k contenidas en una secuencia biológica.El único dominio repetido en las construcciones resultantes contiene 33 residuos de aminoácidos de la siguiente forma:
NH 2 -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.
El peso molecular teórico de las proteínas diana, incluidas las secuencias que no son de idroína (regiones de escisión de His-Tag, S-Tag, enteroquinasa y trombina) en el extremo N-terminal es de 7,9 kDa para 1-mer (81 aa); 10,5 kDa para 2-mer (114 aa); 13,1 kDa para 3-mer (147 aa) y 20,9 kDa para 6-mer (246 aa).
Sí , designación de la unidad de masa atómica; kDa - kilodalton (1 kDa = 103 Da).Además de confirmar la expresión de las proteínas MaSp1, también se evaluó su cantidad de proteínas MaSp1 obtenidas de cultivos recombinantes de R.sulfidophilum : ~ 3-10 mg / L (1-mer = 3.4 mg / L; 2-mer = 3.9 mg / L ; 3-mer = 10,2 mg / l; 6-mer = 6,8 mg / l) o 3,5-6,9% de la cantidad total de proteínas. A modo de comparación, la expresión heteróloga de las espidroínas en el sistema recombinante bien conocido y ampliamente utilizado de E. coli es capaz de producir sólo ~ 0.3 a 1.2 mg / L de espidroína purificada.
El alelo dominante se indica con una letra mayúscula (A versus a). Dado que cada padre proporciona un alelo, son posibles las siguientes combinaciones: AA, Aa y aa.
El resultado más sorprendente, según los científicos, de este estudio es la demostración de fábricas de células microbianas basadas en organismos fotosintéticos marinos, en las que se puede aplicar un régimen de crecimiento fotoautótrofo utilizando materias primas renovables no alimentarias y agua de mar como medio de cultivo.
R.sulfidophilum , que lleva pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer), se cultivó en agua de mar artificial (Daigo ASW de agua de mar artificial) cuando se iluminó con LED (730 nm, 20-30 W / m 2 ) con la sal de bicarbonato (1 g / l) como fuente de carbono inorgánico y gas nitrógeno (0,5 l / d) como fuente de nitrógeno. El tiempo de cultivo fue de 7 días ( 2a ).
Imagen No. 2
La unidad constituyente más grande, MaSp1- (6-mer), se eligió para experimentos posteriores porque un mayor peso molecular de MaSp1 daría como resultado una mayor resistencia a la tracción de la fibra de seda de araña. El bicarbonato de sodio se ha utilizado para suministrar carbono inorgánico porque las sales de bicarbonato tienen una mayor solubilidad y menores costos de transporte que el gas CO 2 .
Investigadores anteriores han realizado experimentos para determinar las condiciones de iluminación necesarias para el crecimiento de las células R.sulfidophilum : intensidad (8 y 50 W / m 2 ) y longitud de onda (730, 800 y 850 nm). Este estudio evaluó los efectos del crecimiento de R.sulfidophilum recombinantevarios nutrientes adicionales (extracto de levadura, vitamina, hierro y fósforo) que son deficientes en los medios ASW.
La masa de células secas (CDM) disminuyó de 0,90 g / L (con todos los nutrientes) a 0,66 g / L en ausencia de extracto de levadura y a 0,39 g / L en ausencia de fósforo. También se determinó que R.sulfidophilum recombinante no puede crecer en medio ASW sin NaHCO 3 , gas N 2 o fósforo ( 2b ; ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P y ASW + P + N 2 ).
CDM (~ 0.4 g / L) en tales variantes de medio ASW, muy probablemente, se originó a partir de inoculantes *o inóculo incluso después de lavar las muestras con cloruro de sodio al 2%. Por tanto, se requieren fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo para el crecimiento de R. sulfidophilum recombinante en medio ASW.
Inoculante microbiológico * : productos biológicos que contienen cultivos vivos de microorganismos útiles para las plantas.Como se esperaba, el crecimiento celular aumentó significativamente de 0.34 ± 0.02 g / L (ASW + C + N 2 ) a 0.58 ± 0.08 g / L (aumento de 1.7 veces) y 0.81 ± 0.02 g / L (aumento de 2.4 veces) en presencia de extracto de levadura (ASW + C + N 2 + YE) y fósforo (ASW + C + N 2 + P), respectivamente.
El CDM más alto se logró agregando extracto de levadura y fósforo, dando 1.04 ± 0.06 g / L (un aumento de 3.1 veces).
El rendimiento de ~ 0,2 mg / L de proteína recombinante MaSp1 (2% de la cantidad total de proteínas) se observó en las condiciones de ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P y ASW + P + N 2 ( 2c y 2d). La producción de la proteína MaSp1 se vio favorecida por la adición de un extracto de levadura, que aumentó significativamente el rendimiento de la proteína MaSp1 de 0,12 ± 0,10 mg / L (ASW + C + N 2 ) a 3,93 ± 2,76 mg / L (ASW + C + YE + N 2 ).
La adición de levadura también aumentó el porcentaje de MaSp1 en las proteínas totales de 1,2 ± 1,0 a 6,9 ± 5,3%. Curiosamente, la adición de fósforo, si bien afectó positivamente el aumento de CDM, afectó negativamente la producción de la proteína MaSp1.
En comparación con ASW + C + YE + N 2 en el medio ASW + C + YE + P + N 2 , el rendimiento de la proteína MaSp1 disminuyó a 2.71 ± 1.09 mg / L, y el porcentaje de MaSp1 en las proteínas totales disminuyó a 3.9 ± 1.6%.
La explicación de estas diferencias en la producción de proteínas según el medio de cultivo puede residir en la funcionalidad de cada uno de los componentes. Por ejemplo, el extracto de levadura es principalmente una fuente de nitrógeno que promueve la biosíntesis de proteínas. Mientras tanto, el fósforo es un macronutriente y heteroelemento importante en muchos compuestos celulares importantes, que promueve el crecimiento de productores primarios.
Para obtener la seda de araña en su forma habitual, fue necesario purificar MaSp1.
Imagen # 3
Para obtener suficiente proteína MaSp1 para la extrusión de fibra, se llevó a cabo la fermentación ( 3a ) para producir MaSp1- (6-mer).
En general, el tamaño de las espidroínas se correlaciona positivamente con la resistencia a la tracción hasta un peso molecular específico. Las proteínas más grandes tienen más interacciones intercadena e intracadena, más entrelazamientos y menos defectos en la cadena final.
La purificación de MaSp1- (6-mer) se realizó usando cromatografía de afinidad a través de una etiqueta de histidina, que estaba presente en el extremo N-terminal del casete del gen MaSp1, y cromatografía de filtración en gel. Como resultado, se obtuvieron ~ 10 mg de MaSp1- (6-mer) ( 3b ) purificada a partir de ~ 40 g de CWM.
Las fibras de seda se prepararon pipeteando MaSp1- purificado al 10% en peso (6 medidas) disuelto en hexafluoroisopropanol (HFIP) en un baño de coagulación seguido de extracción manual con fórceps ( 3c). Los mejores resultados se obtuvieron utilizando 90% de 2-propanol como baño de coagulación, lo que provocó una deshidratación relativamente suave, lo que permitió un tirón eficiente del hilo. El análisis por microscopía electrónica de barrido mostró que las fibras tienen un diámetro de 10 a 20 µm y una superficie cubierta con ranuras paralelas al eje de la fibra. La fractografía mostró que la estructura interna constaba de microfibrillas ( 3d y 3e ).
Para un conocimiento más detallado de los matices del estudio, le recomiendo que consulte el informe de los científicos y materiales adicionales .
Epílogo
En este trabajo, los científicos hablaron sobre la creación exitosa de una microfábrica para la producción de la proteína MaSp1. El principal líder de esta producción es la bacteria R.sulfidophilum , gracias a la cual fue posible lograr la expresión fotoheterotrófica de una proteína de telaraña artificial en condiciones de crecimiento fotoautotrófico.
En otras palabras, los científicos modificaron genéticamente la bacteria para producir seda de araña, más específicamente la proteína MaSp1, que es un componente importante de la misma. Además de las manipulaciones genéticas, también fue necesario establecer las condiciones óptimas para el cultivo de la bacteria. Al final resultó que, el entorno ideal es el agua de mar artificial. Además, fue necesario utilizar gas nitrógeno y extracto de levadura como fuentes de nutrientes. Juntos, estos componentes conducen a un crecimiento bacteriano eficiente y, por lo tanto, a la producción de proteína de telaraña.
También es importante que las fibras de tela de araña obtenidas de la proteína sean muy similares en estructura a las naturales producidas por las arañas de la especie Nephila .
Los científicos señalan que su método de cultivo de proteína de seda de araña también se puede utilizar para cultivar otras sustancias. En el futuro, los autores del estudio planean mejorar su microfábrica para aumentar el volumen de producción de proteínas y mejorar las características moleculares del producto resultante.
Según los científicos, su trabajo puede contribuir a solucionar muchos problemas: crisis energética, hídrica y alimentaria, problemas con los residuos sólidos, calentamiento global, etc. La razón de una gama tan amplia de posibilidades es el hecho de que tales fábricas producen materiales biodegradables y biocompatibles utilizando un proceso de carbono neutral.
Gracias por su atención, tengan curiosidad y tengan una buena semana de trabajo, chicos. :)
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