La temperatura es uno de los principales indicadores del estado del sistema biológico. Si una persona desarrolla una infección, su temperatura corporal aumenta (por lo general, pero no siempre), lo cual es un signo de la respuesta del sistema inmunológico a la amenaza. En otras palabras, la temperatura se puede utilizar para determinar el estado aproximado del cuerpo. El problema es que una persona es grande (literalmente), pero, por ejemplo, los nematodos solo miden alrededor de 1 mm de largo. Era extremadamente difícil medir la temperatura de un organismo tan pequeño, pero científicos de la Universidad de Osaka (Japón) han desarrollado un método para resolver este problema. ¿Qué medios se utilizaron para implementar el nanotermómetro, qué experimentos prácticos se han demostrado y dónde se puede utilizar este desarrollo? Encontraremos respuestas a estas preguntas en el informe de los científicos. Vamos.
Base de investigación
La temperatura corporal de un organismo vivo varía según el grado de influencia de factores internos y externos. Estamos acostumbrados a que la temperatura ambiente afecte directamente a la temperatura de las personas de sangre fría, por tanto, sus valores cambian con envidiable regularidad. Sin embargo, incluso en animales de sangre caliente en condiciones fisiológicas normales, se observan fluctuaciones de temperatura, que pueden estar asociadas con termorregulación homeostática y metabolismo energético.
En otras palabras, el chiste es genial aquí: "No estoy bromeando, soy una persona muy ocupada a nivel celular". Al medir con precisión la temperatura y su dinámica en una escala submicrométrica, se puede obtener mucha información sobre la actividad celular y molecular. El problema es que a medida que disminuye el objeto de medición, aumenta la complejidad de su conducta (es difícil poner un termómetro ordinario de una farmacia en un nematodo).
Los autores del estudio señalan que los termómetros eléctricos convencionales no tienen una resolución submicrónica, y la termografía del infrarrojo cercano generalmente ayuda a determinar la temperatura de la superficie de las muestras biológicas, pero no la temperatura interna.
Por supuesto, ya existen nanotermómetros emisores de luz (por ejemplo, sondas moleculares termosensibles) que son capaces de superar esta limitación. Pero esta técnica también tiene desventajas. El principal es la estabilidad a largo plazo, o más bien su ausencia. Dichos dispositivos no pueden medir con precisión los cambios de temperatura que llevan mucho tiempo (digamos un par de horas). Por no mencionar el efecto tóxico en la muestra de dicho termómetro.
En este trabajo, los científicos describen el concepto de un termómetro cuántico de nanodiamantes (ND de nanodiamond ), que es altamente preciso, robusto y de baja toxicidad. El principio de su funcionamiento es el siguiente: el sensor lee la temperatura como un cambio de frecuencia de la resonancia magnética detectable ópticamente (ODMR deresonancia magnética detectada ópticamente ) de centros defectuosos de vacantes de nitrógeno (NV de nitrógeno-vacante ), que surge principalmente debido a la expansión térmica de la red. El núcleo del sensor NV está profundamente incrustado en la red de diamante y es inmune a varios factores ambientales biológicos. La introducción de este sensor cuántico en organismos más complejos hace posible leer su actividad térmica en un sitio específico en tiempo real. Pero el proceso de implementación de tal técnica está plagado de una serie de dificultades.
Nematoda (gusano redondo) de la especie Caenorhabditis elegans .
Organismos modelo multicelulares como los gusanos Caenorhabditis elegans, necesitan una cámara especial que pueda acomodar un cuerpo de tamaño milimétrico, y las propias muestras deben analizarse rápidamente para mantener su estado fisiológico. Los termómetros Quantum ND se mueven mucho más rápido que las células cultivadas, incluso si el cuerpo está deshidratado, lo que requiere un algoritmo de seguimiento de partículas rápido. Además, el movimiento posicional del ND y la estructura compleja del cuerpo provocan fluctuaciones significativas en la intensidad de fluorescencia detectada, lo que probablemente provoque artefactos de medición de temperatura. La solución a estos problemas en esta etapa del estudio está asociada a la adaptación del dispositivo a las características individuales de la muestra analizada. Está previsto que en trabajos futuros se tenga en cuenta la cuestión de la versatilidad y la facilidad para configurar el futuro nanotermómetro.Mientras tanto, se prestó atención al concepto en sí y a los principios básicos del trabajo.
, .
La base del nanotermómetro es un microscopio de fluorescencia confocal equipado con una unidad de irradiación de microondas (1A).
Imagen # 1 El
ODMR de las vacantes de nitrógeno se puede medir como una disminución en la intensidad de la fluorescencia inducida por láser cuando se aplica la excitación de microondas por resonancia de espín, ya que la excitación de espín activa la vía de relajación no fluorescente del estado excitado al estado fundamental ( 1B ).
La cámara de muestras es un plato con fondo de vidrio desechable integrado en la antena que proporciona un gran acceso óptico (12 mm de diámetro) y facilidad de uso ( 1C ) adecuado para muestras delicadas como las células madre. Tiempo desde la captura del gusanoCaenorhabditis elegans es solo 15 minutos antes de la medición real. Esto ayuda a mantener vivo al gusano y proporciona más datos sobre su salud.
Además, el sistema integra eficazmente el seguimiento rápido de partículas y la estimación de temperatura en tiempo real de alta precisión desde el ODMR de compensación central de NV.
En el seguimiento de partículas, el sistema mide la intensidad de fluorescencia ND a lo largo de los ejes xyz del microscopio y se enfoca en la fluorescencia máxima correspondiente cada 4 segundos (es posible un intervalo de seguimiento más corto) durante el cual se estima la temperatura con un tiempo de muestreo de 0,5 a 1,0 segundos. ( 2A ).
Imagen No. 2
Existen varios métodos de termometría cuántica, pero en este trabajo se utilizó el método de medidas de cuatro puntos ODMR. Este método supone que el número de fotones detectados en las cuatro frecuencias seleccionadas se escala linealmente de acuerdo con los cambios en la intensidad de fluorescencia detectada.
Sin embargo, se encontró que cada fotón subsiguiente muestra una diferencia en la sensibilidad a la luz de aproximadamente ∼0.5%, lo que en realidad crea artefactos significativos en la estimación del cambio de frecuencia (es decir, ∼300 kHz, que corresponde a varios grados Celsius), especialmente en el modo de fotones bajos.
Estos artefactos se deben muy probablemente a la asimetría dependiente de la potencia óptica en el espectro ODMR. Para medir con precisión la temperatura de sistemas dinámicos ópticos complejos (es decir, sistemas biológicos), es necesario deshacerse de tales artefactos. Por lo tanto, se ha agregado un filtro de corrección de errores al método de medición de cuatro puntos.
Para evaluar el funcionamiento del sistema, junto con la corrección de errores, se realizaron mediciones en tiempo real de la temperatura ND durante eventos térmicos escalonados. Los cambios bruscos de temperatura no se pueden utilizar, ya que los cambios bruscos de temperatura provocan un gran desenfoque de los puntos focales y fluctuaciones asociadas en la intensidad de la fluorescencia.
En 2B muestra los perfiles de tiempo del número total de fotones (I tot) y estimación de temperatura ND (∆T NV ) cuando la temperatura de la muestra (T S ) cambia de 44,3 ° → 30,4 ° → 44,3 ° con un paso de ∼2,8 °. El sistema emite con precisión ∆T NV , correspondiente a T S , mientras que la posición de enfoque se ha movido significativamente, especialmente a lo largo del eje z en una distancia de más de 30 μm ( 2C ).
Con un paso de 3 °, aparece un cambio de posición de 6 μm en el eje z en 3-4 minutos, pero la velocidad de seguimiento es lo suficientemente alta como para seguir la dinámica de 105 nm / s durante 96 minutos ( 2C ).
Además, ∆T NV demuestra claramente una anticorrelación con I tot... Un estudio estadístico de este tipo de dependencia de la temperatura determina los valores medios para SD: I tot -1 dI tot / dT = -3,9 ± 0,7% / ° y dD / dT = - 65,4 ± 5,5 kHz / ° ( 2D ). La precisión de la medición de temperatura es de ± 0,29 ° y <0,6 ° C, respectivamente, lo que da una sensibilidad de 1,8 ° C / √Hz.
Después de lograr una termometría confiable y precisa en tiempo real como parte de la fase de desarrollo, se realizó una prueba de monitoreo de temperatura local en gusanos vivos.
Imagen №3 La
fotografía 3A muestra gusanos anestesiados con ND en el interior, colocados cerca de antenas de microondas. Estos ND están bien dispersos en agua debido a la funcionalización superficial del poliglicerol (PG depoliglicerol ) y se introducen mediante microinyección en las gónadas (gónadas del gusano experimental).
El gráfico 3B muestra el espectro ODMR de un solo ND (marcado con una flecha en 3A ). 3C muestra los perfiles de tiempo de I tot y Delta T NV durante un período de 1 hora como la temperatura T S cambia .
Primero, T obj se midió a 33,2 ° C, después de 6 minutos, se realizó una disminución a 25,3 ° C. Como resultado, Tobj alcanzó los 28,6 ° a los 35,2 minutos. ∆T NV mostró un cambio de temperatura exacto entre dos estados estacionarios: 33,2 y 28,6 ° C.
La visualización de la dinámica real de la temperatura dentro de los gusanos entre estos dos estados estacionarios se muestra debido al hecho de que ∆T NV siempre va por detrás de T S y muestra una respuesta ligeramente subestimada debido a la capacidad calorífica finita del objetivo del microscopio y el medio ambiente. I tot también muestra los cambios graduales en la intensidad de fluorescencia causada por la temperatura.
El seguimiento de partículas también fue satisfactorio ( 3C ). En 0-15 minutos, los fotones contados muestran ráfagas frecuentes debido a las fluctuaciones de posición del ND a aproximadamente 400 nm durante varios segundos.
Los resultados de la prueba indican claramente la alta precisión de la medición de temperatura dentro del sistema biológico a nanoescala en tiempo real. Además, se decidió realizar pruebas adicionales, antes de lo cual los gusanos experimentales se sometieron a tratamiento farmacológico con C 10 H 5 F 3 N 4 O (FCCP de cianuro de carbonilo-4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona ), provocando termogénesis inmóvil (en términos generales, un aumento de temperatura debido a un aumento metabolismo y sin actividad muscular adicional).
Imagen №4
Pictured 4A muestra ND gusanos estimulados por FCCP. Y la gráfica 4B muestra el perfil de tiempo de ∆T NVND marcado con una flecha en las imágenes.
En el séptimo minuto después del inicio de la medición, se utilizó la solución de FCCP. En el minuto 32, ∆T NV comienza a aumentar gradualmente, y en el minuto 48, se observa un aumento adicional aún mayor cuando el nivel de cambio de temperatura aumenta de 4 a 7 ° C. La fiebre duró unos 80 minutos.
Durante la estimulación, los ND se mueven lentamente unos pocos micrómetros durante una hora, lo que confirma los resultados de experimentos separados en los que los ND se observaron continuamente bajo un microscopio.
El grupo de control de gusanos ( 4C y 4D ), que no fueron inyectados con FCCP, mostró una respuesta uniforme de ∆T NV durante toda la prueba sin ningún cambio de temperatura obvio.
Para confirmar aún más que el FCCP en realidad induce un aumento de la temperatura corporal en los gusanos, se realizó la cuantificación de los gusanos marcados con ND en los grupos de control y de tratamiento ( 4E ). El gráfico indica claramente un aumento de temperatura en los gusanos del grupo experimental en comparación con el control.
Otro experimento de control, en el que no se agregó tampón y el ∆T NV se controló estáticamente, muestra que la adición del dopante hace que el ∆T NV fluctúe a un cierto nivel, ya sea debido a cambios de temperatura o debido a artefactos de cambio ODMR. Sin embargo, la observación de tal cambio es imposible con la adición de FCCP, que además confirma el aumento de temperatura debido a FCCP en el grupo experimental de gusanos ( 4F).
Para un conocimiento más detallado de los matices del estudio, le recomiendo que consulte el informe de los científicos y materiales adicionales .
Epílogo
En este estudio, los científicos pudieron desarrollar una metodología que le permite medir con precisión la temperatura dentro de un sistema biológico a nanoescala en tiempo real. De manera exagerada, lograron medir la temperatura corporal del gusano Caenorhabditis elegans , que mide aproximadamente 1 mm de largo.
Es importante comprender que es mucho más fácil medir cualquier cosa en una muestra grande que en una pequeña. Sin embargo, el uso de nanodiamantes inyectados en el cuerpo de los gusanos permitió conocer la temperatura corporal del gusano en condiciones normales. Estos nanodiamantes, al entrar en el cuerpo, comienzan a moverse rápidamente. Un algoritmo especialmente desarrollado y un microscopio de fluorescencia confocal hicieron posible rastrear y analizar su movimiento. Los datos obtenidos permitieron determinar con precisión la temperatura corporal del gusano y su dinámica, incluso después de la introducción de una sustancia especial que provocó un aumento de temperatura.
Este trabajo no solo muestra que las tecnologías cuánticas pueden y deben aplicarse en biología, sino que también amplía el abanico de posibilidades en el aspecto del diagnóstico de diversos procesos a nivel macro. Muy a menudo, el estado de un sistema biológico depende directa o indirectamente de los procesos que ocurren dentro de las células, que anteriormente eran extremadamente difíciles de medir en tiempo real. Habiendo recibido más información sobre los elementos constitutivos del sistema, puede comprender mejor el sistema en sí, lo que, por supuesto, le permitirá influir de manera más efectiva en su funcionamiento.
Gracias por su atención, ¡tengan curiosidad y tengan un gran fin de semana, chicos! :)
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